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PCR實驗室

PCR實驗室由緩沖區(qū)及四個單獨的工作區(qū)域

PCR實驗室

       PCR實驗室由緩沖區(qū)及四個單獨的工作區(qū)域
      緩沖區(qū)、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
      PCR實驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制
      PCR實驗室關(guān)鍵控制好各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保住各實驗區(qū)的階梯式壓力要求及達(dá)到安全排放標(biāo)準(zhǔn)。
      PCR實驗室又叫基因擴(kuò)增實驗室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)
     PCR實驗室建立方法
     1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
      這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施:⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
     2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
      RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。
       3、建立前PCR區(qū)。
       該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
       4、PCR實驗室試劑的操作。
     （1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
      （2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
     （3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
     （4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。
       （5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
     （6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。
      （7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。
       5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。
       （1）可以把即刻可用的"主混合物"溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
       （2）如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
       （3）作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
      （4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
     （5）當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
      （6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。
     6、控制污染的方法。
     已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染-使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
       7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。

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